TRAP染色實驗代測

TRAP染色簡介：

TRAP是酸性磷酸梅（ACP）同功酶6種同工酶（0－5）中的第5型，OC含量zui為豐富，通常作為鑒別OC的重要標志。染色目的主要作用于EDTA脫鈣的骨組織內破骨細胞(紅色，背景藍色)，TRAP染色結果顯示OC胞漿陽性，呈酒紅色，核呈陰性。

骨組織切片及trap染色實驗步驟（僅供參考）：

1、骨組織脫鈣：新鮮骨組織固定于4%多聚甲醛24h以上。將組織從固定液取出置于EDTA脫鈣液內脫鈣（不能用含酸的脫鈣液脫鈣），每3天換一次脫鈣液，至骨組織針扎可以順利通過為止。

2、取材：在通風櫥內用手術-刀將目的部位組織修平整，將修切好的組織和對應的標簽放于脫水盒內。

3、脫水：將脫水盒放進吊籃里于脫水機內依次梯度酒精進行脫水。75%酒精4h-85%酒精2h-90%酒精2h-95%酒精1h-無水乙醇I 30min-無水乙醇II 30min-醇苯5-10min-二甲苯I 5-10min-二甲苯II 5-10min-蠟I 1h-蠟II 1h-蠟III 1h。

4、包埋：將浸好蠟的組織于包埋-機內進行包埋。先將融化的蠟放入包埋框，待蠟凝固之前將組織從脫水盒內取出按照包埋面的要求放入包埋框并貼上對應的標簽。于-20°凍臺冷卻，蠟凝固后將蠟塊從包埋框中取出并修整蠟塊。

5、切片：將修整好的蠟塊置于石蠟切片機上切片，片厚4μm。 切片漂浮于攤片機40℃ 溫水上將組織展平，用載玻片將組織撈起，并放進60℃ 烘箱內烤片。待水烤干蠟烤化后取出常溫保存備用。

6、石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ20min-二甲苯Ⅱ20min-無水乙醇Ⅰ10min-無水乙醇Ⅱ10min-95%酒精5min-90%酒精5min-80%酒精5min-70%酒精5min-蒸餾水洗。

7、染液配制：A液：0.1mol/L醋酸緩沖液PH5.0：醋酸鈉1.3608g+蒸餾水100ml溶解，用冰醋酸調PH值到5.0。B液：六偶氮副品紅 4%亞硝-酸鈉：2g亞硝-酸鈉+去離子水50ml

副品紅溶液：副品紅2.5g+去離子水50ml+濃鹽酸7.5ml，加熱至90°溶解后過濾，4°棕色瓶保存。臨用前4%亞硝-酸鈉與副品紅溶液等比例混合。

C液：萘酚AS-BI磷酸酯20mg+N,N-二甲基甲酰胺1ml溶解。

孵育液配制：A液18ml+B液1ml+C液1ml混勻，用1M NaOH或1M鹽酸調pH至5.0，再加酒石酸鉀鈉0.282g，充分溶解過濾后備用即為TRAP孵育液。

8、染色：切片置于TRAP孵育液內37°孵育50min，鏡下觀察破骨細胞呈酒紅色為止。蒸餾水漂洗。

9、蘇木素染細胞核：切片入Harris蘇木素染3-8min，自來水洗，1%的鹽酸酒精分化數秒，自來水沖洗，0.6%氨水返藍，流水沖洗。

10、脫水封片：將切片依次放入95%酒精I 5min -95%酒精II 5min-無水乙醇Ⅰ5min -無水乙醇Ⅱ5min -二甲苯Ⅰ5min -二甲苯Ⅱ5min中脫水透明，將切片從二甲苯拿出來稍晾干，中性樹膠封片。

11、顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。

染色結果：EDTA脫鈣的骨組織內破骨細胞(紅色，背景藍色)

TRAP染色實驗代測