免疫熒光三標四色（切片）

服務介紹：

免疫熒光三標即利用酪胺信號放大（TSA，Tyramide signal amplification）即TSA技術，在同一張切片上對三種蛋白同時進行標記，從而可實現對多種蛋白空間定位，定性及半定量分析。

TSA技術主要原理為熒光標記的酪胺在二抗上偶聯的HRP與H₂O₂的作用下變為活化的酪胺并附著在靶標周圍的蛋白酪-氨酸殘基上，此結合是共價結合。而一抗與靶標、二抗與一抗之間是非共價結合。通過抗體洗脫液處理，非共價結合的一抗二抗被洗脫掉，而共價結合的熒光酪胺依然附著在靶標周圍，將靶標通過熒光標記顯示出來。在檢測第二個靶標時，相當于全新的一輪標記，無需考慮第二輪的抗體是否與第一輪的抗體產生交叉反應。只需改變不同種類熒光染料標記TSA即可實現多個靶標的標記。通過多次重復免疫標記，使用不同的熒光酪胺實現雙重或多重熒光染色。

送樣運輸要求：

1、石蠟切片常溫保存運輸，冰凍切片﹣20℃保存運輸

2、細胞爬片PFA固定15min后用無菌PBS洗滌，無菌PBS浸泡，4℃冰袋保存運輸到實驗室

實驗大體流程：

石蠟切片脫蠟至水——微波抗原修復——畫圈雙氧水封閉——血清封閉——孵育第一種一抗

——孵育HRP二抗——孵育iF488-TSA——抗體洗脫——血清封閉——孵育第二種一抗

——孵育HRP二抗——孵育iF555-TSA——抗體洗脫——血清封閉——孵育第三種一抗

——孵育HRP二抗——孵育iF647-TSA——DAPI染核——自發熒光淬滅——抗熒光淬滅封片劑封片——掃描全景成像。

（TSA熒光染料的搭配及加樣順序根據各抗體的表達情況來確定。）

實驗具體流程：

1、石蠟切片脫蠟至水：依次將石蠟切片放入環保型脫蠟液I 10min-環保型脫蠟液II 10min-環保型脫蠟液III 10min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ5min-無水乙醇Ⅲ 5min-蒸餾水洗。

2、抗原修復：組織切片置于盛滿抗原修復緩沖液PH 6.0 檸檬酸； PH 9.0 EDTA；PH 8.0 EDTA）的抗原修復盒中于微波爐內進行抗原修復。維持緩沖液沸騰10min左右，此過程中應防止緩沖液過度蒸發，切勿干片。自然冷卻后將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min(修復液種類和修復條件根據組織來確定，優先推薦 PH 6.0 檸檬酸修復液）。

3、畫圈, 雙氧水封閉：切片稍甩干后用免疫組化筆在組織周圍畫圈（防止試劑流走），切片平放于避光濕盒滴加3%雙氧水溶液，室溫避光孵育25 min左右，封閉內源性過氧化物酶。將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

4、血清封閉:切片平放于避光濕盒滴加血清室溫封閉30min。一抗是山羊來源用10%兔血清封閉，一抗其它來源的用3%BSA封閉。

5、加第一種一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加用無菌PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于避光濕盒內4°C孵育過夜（濕盒內加少量水防止抗體蒸發）。

6、加對應種屬HRP標記二抗：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后平放于透明濕盒在圈內滴加與一抗相應種屬的HRP標記的二抗覆蓋組織，室溫孵育50min。

7、加iF488-TSA：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內滴加iF488-TSA，避光室溫孵育10min。 孵育完后，將玻片置于TBST中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

8、抗體洗脫：切片稍甩干后，滴加抗體洗脫液鋪滿整個組織，室溫孵育5 min后去除抗體洗脫液，再次滴加足量的抗體洗脫液完-全覆蓋組織，37°C孵育30 min，孵育完成后將玻片置于TBST中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

9、血清封閉:切片平放于避光濕盒滴加血清室溫封閉30min。一抗是山羊來源用10%兔血清封閉，一抗其它來源的用3%BSA封閉。

10、加第二種一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加用無菌PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于避光濕盒內4°C孵育過夜（濕盒內加少量水防止抗體蒸發）。

11、加對應種屬HRP標記二抗：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內滴加與一抗相應種屬的HRP標記的二抗覆蓋組織，室溫孵育50min。

12、加iF555-TSA：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內滴加iF555-TSA，避光室溫孵育10min。 孵育完后，將玻片置于TBST中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

13、抗體洗脫：切片稍甩干后，滴加抗體洗脫液鋪滿整個組織，室溫孵育5 min后去除抗體洗脫液，再次滴加足量的抗體洗脫液完-全覆蓋組織，37°C孵育30 min，孵育完成后將玻片置于TBST中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

14、血清封閉:切片平放于避光濕盒滴加血清室溫封閉30min。一抗是山羊來源用10%兔血清封閉，一抗其它來源的用3%BSA封閉。

15、加第三種一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加用無菌PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于避光濕盒內4°C孵育過夜（濕盒內加少量水防止抗體蒸發）。

16、對應的HRP標記的二抗：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內滴加與一抗相應種屬的HRP標記的二抗覆蓋組織，室溫孵育50min。

17、加iF647-TSA：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內滴加iF647-TSA，避光室溫孵育10min。 孵育完后，將玻片置于TBST中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

18、DAPI復染細胞核：切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內滴加DAPI染液，避光室溫孵育10min。將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

19、自發熒光淬滅：切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內加入自發熒光淬滅劑5min，流水沖洗10min。

20、封片：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。