免疫熒光三標四色（芯片）

服務介紹：　　

組織芯片的免疫熒光檢測，是將許多不同個體組織標本以規則微陣列方式排布于同一載玻片上，同時進行相同指標的免疫熒光檢測。組織芯片熒光三標實驗室在同一張組織芯片上對三個抗原進行同時標記，從而實現定性，定位，半定量分析。 組織芯片的免疫熒光檢測，標本體積小, 標本信息含量大 , 一次性實驗即可獲大量結果。實驗條件更易控制一致，減少批間批內誤差，結果更準確。

實驗流程：

1. 石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入環保型脫蠟液10min-環保型脫蠟液10min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ5min-無水乙醇Ⅲ5min-蒸餾水洗。

2. 抗原修復：組織切片置于盛滿EDTA抗原修復緩沖液（PH8.0）的修復盒中于微波爐內進行抗原修復。中火8min停火8min轉中低火7min，此過程中應防止緩沖液過度蒸發，切勿干片。自然冷卻后將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。(修復液和修復條件根據組織來確定）

3. 畫圈：切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈（防止抗體流走）

4. 血清封閉:在圈內滴加BSA孵育30min。（一抗若是山羊來源，則加兔血清）

5. 加第一種一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于濕盒內4°C孵育過夜。（濕盒內加少量水防止抗體蒸發）

6. 加對應的HRP標記的二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內滴加與一抗相應種屬的HRP標記的二抗覆蓋組織，室溫孵育50min。

7. 加CY3熒光增強劑：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內滴加CY3熒光增強劑，避光室溫孵育10min. 孵育完后，玻片置于TBST中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min

8. 微波處理：組織切片置于盛滿EDTA抗原修復緩沖液（PH8.0）的修復盒中于微波爐內加熱處理，中火8min停火8min轉中低火7min，去掉已經結合到組織上的一抗二抗，此過程中應防止緩沖液過度蒸發，切勿干片。

9. 加第二種一抗：在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于濕盒內4°C孵育過夜。（濕盒內加少量水防止抗體蒸發）

10. 加對應的HRP標記的二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內滴加與一抗相應種屬的HRP標記的二抗覆蓋組織，避光室溫孵育50min。

11. 加FITC熒光增強劑：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內滴加FITC熒光增強劑，避光室溫孵育10min. 孵育完后，玻片置于TBST中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min

12. 微波處理：組織切片置于盛滿EDTA抗原修復緩沖液（PH8.0）的修復盒中于微波爐內加熱處理，中火8min停火8min轉中低火7min，去掉已經結合到組織上的一抗二抗，此過程中應防止緩沖液過度蒸發，切勿干片。

13. 加第三種一抗：在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于濕盒內4°C孵育過夜。（濕盒內加少量水防止抗體蒸發）

14. 加CY5標記的熒光二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內滴加與一抗相應種屬的CY5標記熒光二抗覆蓋組織，避光室溫孵育50min。孵育完后，玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

15. DAPI復染細胞核：切片稍甩干后在圈內滴加DAPI染液，避光室溫孵育10min。

16. 自發熒光淬滅：切片稍甩干后，在圈內加入自發熒光淬滅劑5min，流水沖洗10min。

17. 封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。

18. 鏡檢拍照：切片置于掃描儀下采集圖像。（DAPI紫外激發波長330-380nm，發射波長420nm，發藍光；FITC激發波長465-495nm，發射波長515-555 nm，發綠光；CY3激發波長510-560，發射波長590nm，發紅光. CY5激發波長 608-648nm, 發射波長672-712,，CY5原本為正紅色，為了與CY3區分開，我們設定為粉色光。 DAPI染出來的細胞核在紫外的激發下為藍色，陽性表達為相應熒光素標記的紅光，粉光，綠光 。

送樣運輸要求：

1、樣本放置于20倍樣本體積的固定液中固定24h以上，常溫運輸送樣。切勿固定時間過長，切勿冷凍結冰。

2、熒光三標只能做石蠟包埋切片，不能做冰凍切片和細胞爬片。