上海信帆生物：免疫金銀染色雙PAG法的操作步驟

雙PAG免疫金銀染色原理

(一)染色流程：

(1)石蠟切片常規脫蠟至水，0.05mol/L(pH7.4)TBS洗3×3min.

(2)0.1%胰蛋白酶37℃消化20min,或抗原修復20min(98℃)，自然冷卻至室溫。

(3)0.05mol/L(pH7.4) TBS洗3×3min.

(4)1%EA(卵蛋白)15min,不洗。

(5)適當稀釋的特異抗體室溫4h或4℃孵育20h,或37C孵育30min.

(6)0.05mol/L(pH7.4)TBS洗3×5min.

(7)0.02mol/L(pH7.4)TBS(內含0.1%BSA)洗10min.

(8)1%EA 15min,不洗，滴加PAGlonm 1:40稀釋，室溫1h,

(9)0.05mo!/L(pH7.4)TBS洗10min.

(10)兔抗SPAIgGl:400稀釋，37℃ 30min.

(11)0.05mol/L(pH7.4)TBS洗10min.

(12)滴加PAGlonm 1:60稀釋，室溫1h,或37℃ 30min.

(13)0.05mol/L(pH7.4)TBS洗10min.

(14)1%戊二醛洗10min.

(15)雙蒸水洗5min.

(16)1%明膠洗5min.

(17)銀避光顯影8~15min.

(18)雙蒸水洗15min.

(19)固定：用顯影定影液(1:4或1:10)固定5min,也可以用15%硫酸鈉-20%硫代硫酸鈉混合液固定1~3rain，或用1%戊二醛固定5min,50℃溫水洗3~6min.

(20)襯染：核固紅襯染3min或甲基綠襯染3min.

(21)常規脫水，樹膠封片。

(22)鏡檢：陽性物質呈黑色或黑褐色，顆粒分布于抗原-抗體反應部位;背景較干凈，呈紅色。

(二)雙PAG法的敏感性

應用本法對keratin、AFP、HBsAg、FN、SOD、HCG、F8、P53等組織抗原的定位，連續4gm石蠟切片，同時用IGSS和雙PAG法，不同的一抗稀釋度，結果雙PAG法要比IGSS法敏感5~8倍，抗體的稀釋度從1: (1000~5000)提高到1: (10000-50000)，大大節約了*抗體。尤其組織細胞內抗原性較弱，抗原丟失嚴重，應用雙PAG法均能得到有效的檢測，陽性檢測率和陽性強度有了明顯的提高。某些抗原用單一的SPA金標探針對某些抗原只能獲得低強度的染色，當用雙PAG法時可獲得強的特異性染色。

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