基質(zhì)金屬蛋白酶MMP2/9活性檢測試劑盒,明膠酶譜法注意事項

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      我們在做明膠酶譜法實驗的時候，總是會遇到很多這樣那樣的問題，那么這個基本原理是什么，我們操作過程中應(yīng)該注意哪些問題呢，上海信帆生物為您答疑。

      酶譜法的基本過程是先將樣品進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE，含0.1％明膠）電泳分離，然后在有二價金屬離子存在的緩沖 系統(tǒng)中使樣品中的MMP-2和MMP-9恢復(fù)活性，在各自的遷移位置水解凝膠里的明膠，zui后用考馬斯亮藍(lán)將凝膠染色，再脫色，在 藍(lán)色背景下可出現(xiàn)白色條帶，條帶的強(qiáng)弱與MMP-2和MMP-9活性成正比。
 
        復(fù)性原理：在電泳過程中，SDS與樣品中的MMPs結(jié)合（當(dāng)然是可逆性結(jié)合），破壞其氫鍵、疏水鍵而使MMPs不能發(fā)揮其分解明膠的作用，而只有當(dāng)將膠置Trition中洗脫（是放在搖床上搖，30min／次，做2次或15min/次，4次。靜置于Trition中是不妥的。）時，由于SDS被Trition結(jié)合而去除，從而使MMPs恢復(fù)了活性。

操作注意事項：

1.試劑盒的操作方法同WB是一樣的

2.試劑盒的陽性對照，是選用全血做對照，具體如下操作如下：

陽性對照（可選步驟）：可取人、小鼠、大鼠或兔100μl全血與100μl 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer等體積混合，取5-15μl上樣。

3.在操作孵育的時候，建議孵育5小時

4.本試劑盒可以檢測MMP2/9活性，同時可以測定PROMMP2/9，可根據(jù)實驗需要，選取觀察。

5.本試劑盒上樣蛋白建議20ug。

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