組織細胞膜蛋白提取試劑盒的使用方法

本試劑盒能夠從哺乳動物新鮮或凍存的組織塊、貼壁或懸浮細胞中制備細胞 膜與胞內質膜組分。其試劑成分與優化的制備方案使胞膜制備過程簡單易行，無需特殊設備和超速離心，可在1小時內完成。應用本試劑盒制備的胞膜是細胞 膜和細胞器膜如線粒體、內質網及質膜的混合物。制備得到的產物純度可勝任后續的免疫沉淀、蛋白印跡、2-D gel、酶活性檢測和受體分析等實驗。

組成：（以下是50次規格用量）

CER  (Cytosol Extraction Reagent)       25ml    

MER (Membran Extraction Reagent)     2.5ml

Suspension Buffer                      10ml

儲存：各組分4度 有效期12個月

操作步驟：

一．樣本預處理：

收集細胞：（在每一次制備過程中，使用等量的細胞數將明顯提高后續檢測結果的一致性，因此建議在制備前對細胞準確計數）

1.      貼壁細胞：用PBS緩沖液沖洗細胞平皿，用胰蛋白酶消化細胞。800g離心5-10分鐘，棄上清，用PBS緩沖液重懸洗滌細胞并再次離心收集細胞。

2.      懸浮細胞：800g離心5-10分鐘，棄上清。用PBS緩沖液重懸洗滌細胞并再次離心收集細胞。

以下制備過程要在4 oC或冰水浴中進行

二．組織細胞勻漿裂解

1.      細胞勻漿裂解

向每1x107個細胞或每100µl（細胞離心后的體積）細胞沉淀中加入500µlCER試劑，震蕩重懸，冰浴2分鐘。將細胞懸液轉移到冰預冷的玻璃勻漿器內，在冰水浴中上下手動勻漿20-30次。

注意：此破碎細胞步驟為關鍵環節。要使用1-3ml小容積玻璃勻漿器，須選用間隙嚴密的研杵，其特征是將研杵插入勻漿器套管后，可提起研杵而套管不會脫落。有效研磨是上下推拉而不是旋轉。破碎效果與細胞類型有關，可在相差顯微鏡下檢查，未裂解細胞應小于5%。

2.        組織塊勻漿裂解：

取250mg哺乳動物新鮮或-80 oC凍存組織塊放入冰預冷的玻璃勻漿器內，加入500µlCER試劑。用研杵搗碎組織塊，上下手動勻漿20次，冰浴10分鐘，然后上下手動勻漿7次。

注意：與培養細胞特別是貼壁細胞相比，組織塊中的細胞在勻漿時較易破碎，因而并非必須選擇間隙嚴密的研杵。如果研杵與套管過于嚴密，會使組織勻漿困難，可選用研杵與套管稍松的勻漿器，破碎效果與組織細胞類型有關，可在相差顯微鏡下檢查，未裂解細胞應少于5%。

三、粗提物制備：

取約500µl裂解物，轉移到新的離心管中，800g ,4oC離心5分鐘。上清為胞膜-胞漿混合物。

四、胞膜胞漿制備：

1）將步驟三獲得的上清轉移到新的離心管中，估計上清的體積； 2）加入上清液1/10體積的MER與上清液混合，冰浴5分鐘；3）14,000rpm，4oC離心30分鐘；4）沉淀為胞膜組分，含有細胞 膜和亞細胞器碎片，可短暫離心除盡液體，用50-100µl Suspension Buffer重懸備用或用RIPA裂解胞膜；做WB時膜蛋白分子量100KD以上的建議用較強的蛋白提取試劑如加強的RIPA，便于獲取溶解度低的膜蛋白，具體方案根據試驗目的確定。             

說明：

1.       Suspension Buffer不含去垢劑，重懸于Suspension Buffer中的胞膜或胞核組分呈不溶解狀態是正常的，用戶可用自備溶液重懸胞膜或胞核成分。如果進行蛋白印跡、2-D get等實驗，用戶可用SDS上樣緩沖直接裂解細胞 膜或細胞核成分。對于進行免疫共沉淀實驗來說，可用RIPA裂解液（C1053）重懸胞膜。

2.      試劑盒各組分中未添加蛋白酶抑制劑，可自行選擇添加。

組織細胞膜蛋白提取試劑盒的使用方法