信帆生物為您分享：酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）要點

1　免疫吸附劑

　　已包被抗原或抗體的固相載體在低溫（2~8℃）干燥的條件下一般可保存6個月。有些不完整的試盒，僅供應包被用抗原或抗體，檢測人員需自行 包被。以下簡述固相載體和包被過程。

2　固相載體

　　固相載體在ELISA測定過程中作為吸附劑和容器，不參與化學反應?？勺?span>ELISA中載體的材料很多，常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有較 強的吸附蛋白質的性能，抗體或蛋白質抗原吸附其上后仍保留原來的免疫學活性，加之它的價格低廉，所以被普遍采用。聚苯乙烯為塑料，可制成各種形式。

　　ELISA載體的形狀主要有三種：微量滴定板、小珠和小試管。以微量滴定板最為常用，專用于EILSA的產品稱為ELISA板，國際上標準 的微量滴定板為8×12的96孔式。為便于作少量標本的檢測，有制成8聯(lián)孔條或12聯(lián)孔條的，放入座架后，大小與標準ELISA板相同。ELISA板的特 點是可以同時進行大量標本的檢測，并可在特制的比色計上迅速讀出結果。現(xiàn)在已有多種自動化儀器用于微量滴定板型的ELISA檢測，包括加樣、洗滌、保溫、 比色等步驟，對操作的標準化極為有利。聚苯乙烯經射線照射后，其吸附性能特別是對免疫球蛋白的吸附性能增加，應用于雙抗體夾心法可使固相上抗體量增多，但 用于間接法測抗體時空白值較大。

　　良好的ELISA板應該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各孔之間、同一板各孔之間性能相近。聚苯乙烯ELISA板 由于原料的不同和制作工藝的差別，各種產品的質量差異很大，因此，每一批號的ELISA板在使用前須事先檢查其性能。

常用的檢查方法為：以一定濃度的人IgG（一般為10ng/ml）包被ELISA板各孔，洗滌后每孔內加入適當稀釋度的酶標抗人IgG抗體，保 溫后洗滌，加底物顯色，終止酶反應后，分別測每孔溶液的吸光度?？刂品磻獥l件，使各孔讀數(shù)在吸光度0.8左右。計算全部讀數(shù)的平均值。所有單個讀數(shù)與全部 讀數(shù)的均數(shù)之差，應小于10%。

　　與聚苯乙烯類似的塑料是聚氯乙烯。作為ELISA固相載體，聚氯乙烯的特點為質軟板薄，可剪割，價廉，但光潔度不如聚苯乙烯板，孔底亦不如 聚苯乙烯平整。聚氯乙烯對蛋白質的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。

　　為比較不同固相在某一ELISA測定中的優(yōu)劣，可應用如下的試驗：用其他免疫學測定方法選出一個典型的陽性標本和陰性標本，將它們進行一系 列稀釋后，在不同的固相載體上按預定的ELISA操作步驟進行測定，然后比較結果。在哪一種載體上陽性結果與陰性結果差別最大，這種載體就是這一 ELISA測定項目的最合適的固相載體。

　　在ELISA中，用作固相載體的小珠一般為直徑0.6cm的圓珠，表面經磨砂處理后吸附面積大大增加。ELISA板孔的吸附面積約為 200mm2，小珠均為1000mm2，將近ELISA板孔的5倍。吸附面積的增大即意味著固相抗原或抗體量的增加。再者，球型小珠的表面弧度更有利于吸 附的抗原決定簇或抗體結合位點的暴露面處于最佳反應狀態(tài)，因此珠式ELISA的反應往往更為靈敏。小珠的另一特點是更易于使洗滌*，使用特殊的洗滌器， 使小珠在洗滌過程中滾動淋洗，其洗滌效果遠較板孔的浸泡式為好。但由于磨砂工藝的難度較大，小珠的均一性較差。

　　小試管作為固相載體也有較大的吸附表面，而且標本的反應量也相應增加。板式及珠式ELISA的標本量一般為100-200ul，而小試管可 根據(jù)需要加大反應體積，標本反應量的增加有助于試驗敏感性的提高。小試管還可以當作比色杯，最后直接放入分光光度計中比色。

　　也有應用聚苯乙烯膠乳或其他材料制成的微粒作為ELISA固相載體的。其優(yōu)點是表面積極大，反應在懸液中進行，其速率與液相反應近似。以含 鐵的磁性微粒作為ELISA固相載體，反應后用磁鐵的吸引進行分離，洗滌方便，試劑盒一般均配以特殊儀器。

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