ELISA實驗操作篇之：試劑，標本，操作步驟對結(jié)果的影響

酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA） 因其操作簡單，靈敏度高，特異性好，經(jīng)濟安全等特點而在研究上廣泛應用，但是由于其操作步驟復雜，一般包括試劑準備，樣本收集，加樣，溫育，洗滌，顯色，比色，結(jié)果判定等，其中任何一項操作不當都會對檢測結(jié)果產(chǎn)生很大影響。因此，必須加強ELISA檢測的全面質(zhì)量控制，保證其結(jié)果的準確可靠。

1 試劑

的試劑是保證檢驗質(zhì)量的基礎。從4℃冰箱取出的試劑必須放置室溫20～30 min 后再啟用，否則水化層的形成可能影響試劑的原始濃度及試劑中溶質(zhì)分子的均勻分布。未用完的試劑和質(zhì)控品應密封并及時放回冰箱保存。根據(jù)蛋白質(zhì)在冷凍過程中出現(xiàn)蛋白分子分布改變的特點，試劑正式啟用前應充分混勻。所用蒸餾水、去離子水和自行配制的緩沖液等，都必須調(diào)整其pH 值和離子強度等。不同批次的試劑在制作過程中很難保證質(zhì)量*一致，因此必須選擇和訂購長批號的試劑，并保證保存條件，嚴格執(zhí)行這一標準可以避免試劑批號改變而重建質(zhì)控體系及重新評估試劑的復雜過程，并且能夠保證結(jié)果的穩(wěn)定性。

2 標本

患者標本中有可能含有干擾試驗的免疫物質(zhì)，導致假陽性或假陰性的結(jié)果，干擾因素一般可分為兩類，即內(nèi)源性和外源性干擾因素。內(nèi)源性干擾因素一般包括類風濕因子、補體、高濃度的非特異性免疫球蛋白、異嗜性抗體及某些自身抗體等，避免內(nèi)源性干擾因素主要通過選擇合適的試劑；外源性干擾因素包括標本溶血、標本被細菌污染、標本貯存時間過長及標本凝固等。要注意避免標本出現(xiàn)嚴重溶血，標本中血紅蛋白中含有血紅素基因，其具有類過氧化物的活性，因此，在以辣根過氧化物酶（HRP）為標記的ELISA測定試驗中，容易在溫育過程中吸附于固相，從而與加入的底物反應顯色。標本在低溫下保存時間過長，IgG可聚合成多聚體，在間接法ELISA測定中會導致本底加深，甚至出現(xiàn)假陽性結(jié)果。通常血清標本可在2～8℃保存1 周，冷凍保存時間會更長。血清標本應充分離心，否則可因纖維蛋白原非特異吸附于微孔而造成假陽性結(jié)果。冷凍保存標本避免反復凍融，標本的反復凍融會因其所產(chǎn)生的機械剪切力對標本中的蛋白等分子產(chǎn)生破壞作用，使抗體效價下降從而引起假陰性結(jié)果。標本的采集及分離要注意盡量避免細菌的污染。此外，標本在凍存時會因蛋白質(zhì)局部濃縮分布不均，因此重新溶解的標本必須混勻，但不要劇烈振蕩和反復顛倒。

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3 操作因素

3.1 加樣　

加樣器是一種比較精密的工具，其在長時間使用時會因機械磨損或推動桿內(nèi)附著的血痂等原因造成加樣不準，因此必須定期對加液器進行維護和校準。每次加不同的標本均需更換吸嘴，以免發(fā)生交叉污染；加樣速度不可太快，以免將標本加在孔壁上部，并注意不要濺出或產(chǎn)生氣泡，加樣時還應注意操作時差對結(jié)果的影響，尤其對競爭法檢測結(jié)果影響更大。因此建議在加酶結(jié)合物和底物時用多道加液器，或者雙人同時加樣以減少操作時差對結(jié)果的影響，另外有些項目在檢測前需要稀釋以減少非特異性反應。稀釋的方式非常重要，*方式是采用振蕩器混勻，不可隨意改變混勻方式。

3.2 溫育

3.2.1溫育的溫度：育常采用的溫度有43 、37℃、室溫或4℃等。37℃是實驗室中常用的溫育溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的zui適反應溫度。抗原抗體反應一般在37℃經(jīng)1～2 h 產(chǎn)物的生成可達，為加速反應，可在一定范圍內(nèi)提高反應的溫度并在反應過程中連續(xù)振蕩來增加抗原抗體接觸的概率。抗原抗體反應在4℃更為*，形成的產(chǎn)物更多、更穩(wěn)定，但因所需時間太長，在ELISA檢測中一般不予采用。

3.2.2溫育的方式：溫育方式常采用溫箱法、微波輻射法和水浴法。其中水浴法能較好解決因受熱不均衡所致的周圍孔與中央孔結(jié)果的吸光度差異（即“邊緣效應”）。可將ELISA板置于水浴箱中，板底應貼著水面，使溫度迅速平衡，為避免蒸發(fā)，可用塑料貼封紙覆蓋板孔。若用溫箱，ELISA板應放在濕盒內(nèi)，濕盒要選用傳熱性良好的材料（如金屬等），在盒底墊濕的紗布，zui后將ELISA板放在濕紗布上。溫育過程中每塊反應板不能重疊放置，防止溫度擴散的不均勻性。

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