信帆生物帶您了解：Western Blot實驗應(yīng)該如何選擇一抗和二抗

很多老師在做 實驗的時候，不知道應(yīng)該如何來選擇正確的一抗和二抗，信帆生物為您答疑解惑。上海信帆生物專業(yè)提供Western Blot實驗檢測服務(wù)，PCR實驗檢測服務(wù)，免疫組化，免疫熒光檢測服務(wù)，放射免疫檢測服務(wù)，為您的實驗助力！

首先要看你做的是什么物種，根據(jù)物種特異與否選擇單抗或者多抗。

一般小鼠、大鼠等常用模式動物可以選擇鼠源單克隆抗體，其特異性較好，如果是不常見動物模型，建議選擇多克隆抗體。

當然，單抗或者多抗也不是一定的，需要去查詢抗原決定簇的歸屬，一般是找到抗體所對應(yīng)的特異氨基酸序列，到數(shù)據(jù)庫與你要做的物種進行比對，如果匹配度較高（85%以上），則建議購買嘗試。

二抗的選擇相對就簡單了，根據(jù)一抗的種屬特異性進行二抗選擇即可。

如一抗選用鼠源（Mouse）抗體，則二抗選用抗小鼠抗體即可（e.g. Goat Anti-Mouse），注意二抗的反應(yīng)特性（熒光、生物素或HRP偶聯(lián)等）

其次就是多查閱文獻，查看和Western Blot實驗相關(guān)的SCI文獻，查看要做的種屬和指標關(guān)聯(lián)度高的文獻。

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抗體分類：根據(jù)重鏈恒定區(qū)的血清學類型，可將抗體分為IgM，IgG，IgA，IgD，IgE五類，它們的重鏈分別為mu, gamma, alpha, delta, epsilon鏈。在上述每一類別中，按重鏈構(gòu)造上的變異又可分為幾個亞類，例如人的IgG可分為IgG1，IgG2，IgG3，IgG4四個亞類。 輕鏈分為兩種類型，kappa鏈和lambda鏈，但每種抗體中只存在一種類型的輕鏈。 二抗：二抗是在其它宿主體內(nèi)制備的能與一抗或一抗片段結(jié)合的抗體，上面通常連有酶或熒光素等標簽。由于二抗所具備的優(yōu)點使得其在免疫學實驗中得以應(yīng)用廣泛，如western blot（通過與特異性抗體結(jié)合來鑒定蛋白質(zhì)），ELISA（以耦聯(lián)有酶的抗體或抗原為標記來檢測特異性的蛋白質(zhì)，尤其是相應(yīng)的抗原或抗體），免疫組織化學（檢測組織中的特異性抗原），免疫細胞化學（通過免疫學方法檢測細胞的抗原組成），流式細胞術(shù)（通過檢測激光所激發(fā)熒光來鑒定分離不同類型的細胞）及免疫沉淀（通過抗原與抗體的特異性結(jié)合作用來分離相應(yīng)抗原）。二抗針對某一特定物種（如小鼠）的所有抗體均具有特異性，因而使用標記的二抗可以免去對每一個一抗進行標記，大大節(jié)省了時間和費用；此外，一個一抗分子可以同時結(jié)合幾個二抗分子，從而使信號大大增強，提高了實驗靈敏度。

二，如何選擇二抗——根據(jù)一抗種屬及類型選擇合適的二抗

廣義上是指專門和進行特異性反應(yīng)和結(jié)合的抗體，在免疫學反應(yīng)中，經(jīng)常需要針對試驗選擇不同的二抗，上海信帆生物科技有限公司為您的科研工作提供適合和全面的二抗產(chǎn)品。檢測任何目的靶蛋白都有不止一種抗體可供選擇，同時在后繼試驗中也會有不同的檢測方案，因此在選擇二抗的時候要綜合考慮一抗的類型及后繼檢測方案的要求，一般來說，選擇合適的二抗需要從下面幾個方面考慮：【一抗的種屬來源】

二抗應(yīng)選用與使用的一抗相同的物種來源，例如：如果你的一抗是小鼠源的單克隆抗體，二抗則選抗小鼠的二抗（山羊抗小鼠或者兔抗小鼠等均可）；如果一抗是從兔血清里制備的兔源多克隆抗體，則相應(yīng)的二抗需要選擇抗兔的二抗。即根據(jù)一抗的物種來源選擇相應(yīng)的抗該物種的二抗。

二抗需與一抗的類別或亞類相匹配。這通常是針對單克隆抗體而言。多克隆抗體主要是IgG類免疫球蛋白，因此相應(yīng)的二抗就是抗IgG抗體。其中單克隆抗體的類別及亞類通常會在產(chǎn)品說明書中都會有描述，如果你的一抗是小鼠IgM，那么相應(yīng)的二抗就應(yīng)當是抗小鼠IgM。如果單克隆一抗是小鼠IgG的某一亞類（IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3），那么幾乎所有的抗小鼠IgG都可以與之結(jié)合，或者你也可以選擇專門針對這一亞類的二抗，例如，如果你的一抗是小鼠IgG1，那么你可以選擇抗IgG1的二抗，此種抗體在雙標記實驗中尤其適合。在不清楚一抗為何種類/亞類的情況下，可以選用抗相應(yīng)物種IgG。

一般來說，不同的種屬來源與二抗的質(zhì)量沒有必然的聯(lián)系，來源于山羊的二抗與來源于驢的二抗在一般的實驗里沒有太多的差別。然而在一些特殊的實驗里，如雙標實驗里，如果其中一個一抗是山羊來源的，一個是小鼠來源的，則相應(yīng)的二抗分別要抗山羊和抗小鼠的二抗，這時候，二抗就不能選擇山羊或者小鼠來源的。有相應(yīng)的驢來源的二抗，非常適合做類似雙標的免疫實驗。【二抗的耦聯(lián)標記】

一般來講，耦聯(lián)到二抗上的探針主要有酶（辣根過氧化酶HRP和堿性磷酸酶AP或其衍生物APAAP，PAP），熒光基團（FITC、 Rhodamine、Texas Red、PE、Rhodamine、Dylight等）、生物素、金顆粒。選用哪種探針的二抗主要取決于具體的實驗。對于Western Blot和ELISA，常用的二抗是酶標二抗；而細胞或組織標記實驗（細胞免疫化學，組織免疫化學，流式細胞術(shù)）中通常使用熒光基團標記的二抗，免疫組化中也可以使用辣根過氧化酶或堿性磷酸酶標記的二抗。如果想要更大程度的放大檢測信號，可以使用Biotin/Avidin檢測系統(tǒng)。在一些熒光檢測方案中，則需要選擇不同的熒光標記；而金顆粒標記的二抗則更多的應(yīng)用于免疫電鏡中。

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